董莹   云南省疟疾防治研究所  云南思茅  665000

全文发表于《中国寄生虫病防治杂志》2000年第13卷第3期217-220页

 

目前疟疾仍是严重危害人类健康的热带传染病，据WHO近5年的统计，每年平均约有2.1亿人发病，100多万人死于疟疾，世界上有100多个国家有疟疾流行，这些国家中一半的人口生活在疟区，热带非洲国家的人群疟疾发病率均呈上升趋势。而疟原虫抗药性及蚊媒耐药性的产生和迅速扩散，给疟疾的控制带来了更大的难度，似乎我们已经不可能指望采取单一的措施便能降服一种由生活史复杂、抗原高度变异的疟原虫引起的传染病。疟疾疫苗的研制和运用可为疟疾的综合治理提供有力的武器，但对疟原虫免疫机制的肤浅认识及缺乏适当的动物模型，使得有效的临床疟疾疫苗在经历半个世纪后的今天仍是凤毛鳞角。不过随着分子生物学技术的提高和分子免疫学研究的深入，疟疾疫苗已步入核酸疫苗时代，约氏疟原虫核酸疫苗的问世及显示对68%小鼠具有保护作用的结果，极大地鼓舞了疟疾疫苗的研究者。本文依据疟疾疫苗的发展，简介几种重要的疟疾候选疫苗及其作用机理， 并简述对影响疟疾疫苗效果的相关因素。

一、疟疾疫苗及其作用机理

1、子孢子疫苗  最早的疟疾疫苗是采用疟原虫死疫苗或x射线减毒的子孢子活疫苗，这种疫苗虽然曾获得一定的保护性，甚至可刺激机体产生细胞毒性T淋巴细胞，即诱导机体产生对疟原虫全面的保护性免疫应答。但该类疫苗接种时可引起免疫抑制，减毒不充分导致临床感染，减毒过程可使疫苗效价降低，且有毒力回复危险，另外疟原虫来源又困难。为此该类疟疾疫苗不曾在疟疾疫苗发展史中留有一席之地，但它的确是开了疟疾疫苗研制的先河而被载入史册。

2、单价分子─亚单位疫苗

（1）、红细胞前期疫苗   抗子孢子疫苗的研究主要集中在对疟原虫环子孢子蛋白(CSP) 的运用。CSP分子量约40～60kDa，是一种覆盖于成熟子孢子表面的一层表被蛋白，已经发现所有不同种属的疟原虫都有该蛋白存在，其中央1/3为重复序列区，不同种属的疟原虫重复区域的长度、氨基酸组成以及重复次数均有所不同，免疫活性也有很大差异，在恶性疟原虫该重复四肽为天冬酰胺-丙氨酸-天冬酰按-脯氨酸(Asn-Ala-Asn-Pro，NANP)。整个分子的CSP 与AL(OH)₃佐剂免疫20个志愿者，(NANP)₁₉免疫13名成年人，可检测到特异抗体或抗体水平增加，甚至淋巴细胞增殖增加，环化的(NANP)₃诱生的多克隆抗体均可与原虫反应，表明有潜在的保护性。环子孢子抗原的疫苗正在冈比亚进行试验。

恶性疟原虫CSP的(NANP)n重复区内外含有B细胞表位，这些B细胞表位在CSP 诱导的免疫应答中起重要作用，常能直接激活B细胞。从CSP上还鉴定出T细胞位点CS- T₃位于分子的378～398氨基酸之间，在恶性疟原虫不同株间该序列相对保守，且该点能与大多数主要组织相容性复合体(MHC)分子结合，被多种不同基因型的人和小鼠T_H识别，即CS-T₃肽能克服MHC限制性，实验证实CS-T₃肽交联直接免疫7个不同基因型小鼠全部产生了抗子孢子抗体。

抗子孢子疫苗诱生的特异性抗体能防止肝细胞感染或防止原虫在肝内发育，一般认为若该类疫苗对预防原虫感染有任何作用，必然具有很高的效能。因为一只感染蚊的唾液腺常含有几千个子孢子，而每个子孢子能感染一个肝细胞，多数人被一只感染蚊叮咬后，接种的子孢子是很少的，所以一个地区若昆虫接种率很低，则使用该类疫苗可有效降低疟疾发病率，但反之保护力是不能保证的。[NextPage]

    （2）、红细胞内期疫苗  该期的疫苗候选抗原常以多价的形式存在， 主要包括对NSA₁、MSA₂和RESA、HSP等保护性抗原的运用，其免疫原性、保护作用在动物均得到证实。

MSA₁为裂殖子主要表面抗原前体，在裂子体期合成，分子量为180～220kDa。MSA₁分子在不同种疟原虫有不同的多态性，其氨基端为信号肽与一个短的可变重复区相连，该重复区常称为MSA₁R₂，表现为高度变异，其串联重复的三肽SXX在不同株重复数不同，个别株有缺乏，羧基端为疏水跨膜区，并包含两个表皮生长因子样结构，且位于MSA₁加工产物19kDa片段内，该片段在裂殖子侵入红细胞时仍留于红细胞膜表面。针对该19kDa的数个单克隆抗体可以明显抑制裂殖子入侵红细胞，且只包含表皮生长因子样的区域所诱生的特异抗体也可在体外抑制疟原虫生长。研究较多的是以NSA₁分子或其免疫活性亚单位为基础构建融合蛋白或多价亚单位疫苗，如把含有多个B细胞及T细胞表位的MSA₁与RESA杂合，免疫小鼠中有明显的抗体反应及淋巴细胞增殖反应，对约氏疟原虫有部分保护作用。基于MSA₁的血液期人类疫苗正在巴布亚新几内亚进行现场试验。

从MSA₁获得gp190多肽含有至少2个B细胞表位及3个T细胞表位，其中T细胞表位可与多种MHC_Ⅰ分子结合，即MHC并不对裂殖子抗原产生限制作用。实验也证明用该肽刺激疟疾病人外周血淋巴细胞发生增殖。抗MSA₁抗体抑制裂殖子侵入红细胞将会降低原虫密度，而寄生虫密度又与疾病的严重性有关，特别是在无免疫力人群。所以NSA₁诱导的机体保护性免疫有利降低疟疾严重病例的发生。

MSA₂是裂殖子的另一种表面抗原，与MSA₁无关，分子量为45kDa。MSA₂分子中间为重复单位结构，其重复数量、长度和序列多变，且免疫原性强，可诱发高滴度抗体，该特异抗体与恶性疟原虫、夏氏疟原虫可起免疫反应。该可变区也包含有激活B细胞及T细胞的表位，提示本身也具有克服MHC限制的能力，可作为疫苗候选抗原。

RESA是环状体感染的红细胞表面抗原，为成熟裂殖体合成的一种分子量为55kDa 的裂殖子主要蛋白，它首先聚集于裂殖体微线体上， 在裂殖子入侵红细胞过程中或侵入后不久释放并滞留于感染红细胞表面，此抗原在恶性疟原虫的不同虫株间均表现出很强的相似性，且能激起高水平免疫应答。特别位于该蛋白分子的氨基端及羧基端的重复序列结构，具有很强的免疫原活性，  如直接用羧基端重复序列刺激疟区居民外周血淋巴细胞发生增殖增强并释放IFN。B细胞表位多分布在如此的重复序列内。RESA诱导的T细胞反应与多种MHC 基因型间无甚关系，初步认为MHC对RESA特异性免疫应答的调节作用微弱。

以上3种血液期抗原的实验室疫苗，正在巴布亚新几内亚进行现场试验。但更多的是以这3种保护性抗原的免疫活性部分构建多价亚单位疫苗，如恶性疟的Pfs66疫苗。[NextPage]

（3）、抗传播疫苗  由于疟原虫在配子体期表达特异蛋白Pfs48/45，当特异蛋白暴露于机体免疫系统所诱生的特异抗体能阻止配子受精及合子的发育，如体外证实，抗配子体期特异蛋白的抗血清可抑制合子向动合子转变及动合子的成熟。所以该类疫苗虽无直接保护作用，但却可降低疟疾传播。不过阻断作用很大程度上还与当地疟疾传播水平有关，一般昆虫接种率(EIR)低的地区阻断作用更肯定些。

3、多价亚单位疫苗

（1）、化学合成复合多价疫苗  因为疟疾单疫苗的困惑，1988年Patarroyo率先人工合成了基于恶性疟原虫血液期疫苗候选抗原的复合多价45肽疫苗，即恶性疟Pfs66疫苗，它是第一个成功的抗疟疾疫苗，其45肽的构成为恶性疟原虫环子孢子表面抗原重复序列NANP及3个来自裂殖子表面抗原的多肽Pfs35.1、Pfs55.1及Pfs83.1，且Pfs66疫苗为该45肽的多聚物及单体的混合，抗该肽的抗体可抑制体外活子孢子入侵肝细胞、体外裂殖子入侵RBC、蚊体中卵襄的发育，提示该疫苗对恶性疟的各期都可能有效。恶性疟Pfs66自诞生起，已经过无数次的动物试验及不同疟疾流行地区人群接种试验，其中于1992年Patarroyo 本人在哥伦比亚进行的一次小规格临床试验其结果最理想，推算该疫苗对恶性疟保护有效率为82.7%，该水平已高于WHO免疫推广计划(EPI)的规定，即80%的有效率为有效疫苗的标准，其余的临床实验均未达到这个标准，而最近在泰国人群众所做的试验结果显示Pfs66疫苗接种对恶性疟无保护作用。patarroyo多价疫苗在实验中之所以保护作用不定，其原因是多方面的，Pfs66 疫苗化学组成的微小变化可导致试验结果不一，各地区免疫人群对疟原虫的暴露程度不同及疟原虫株间的基因变异直接影响免疫保护能力和免疫应答水平，加之Pfs66疫苗的免疫原性有限。尽管对Pfs66疫苗的效果评价还未终止，但Pfs66疫苗的思路一直贯穿于亚单位疫苗的研制中。

（2）、基因工程多价疫苗  由于化学合成多肽费用很高，限制了Patarroyo的Pfs66 疫苗的规模应用，为了优化Pfs66疫苗45肽的免疫原性及生产过程，国内外先后用45肽基因与外源性T细胞点位基因融合，如用MSA₁、MSA₂、RESA内的T细胞位点与IL-1，破伤风外毒素TT的T细胞位点基因融合并在大肠杆菌表达，已初步证实原核细胞表达的该融合蛋白能与小鼠抗恶性疟原虫红内期抗原的抗体发生特异免疫反应；另外也有通过重塑抗原短肽空间结构来改善抗原免疫活性的，如用HBsAg/45肽融合蛋白，由于45肽抗原活性表位处于HBsAG颗粒表面得以构成近似该表位的天然空间结构，从而有助于增强抗原免疫活性。用该融合蛋白诱导动物产生高水平的抗疟抗体；而以突出多阶段保护的重组疫苗研究，如将CSP基因、MSA₁基因、MSA₂基因、RESA基因全面融合并原核细胞表达得融合蛋白作为疟疾多价疫苗的候选物。或直接将以上4种保护性抗原的T细胞/B细胞表位基因重组原核细胞表达。这些疫苗候选抗原的保护性免疫原性正在研究中。

4、基因工程减毒活疫苗  由于基因工程疫苗的生产，除去基因方面的操作，基因表达产物的分离、纯化过程很繁琐，从而也阻碍了疟疾基因工程疫苗的开发利用。减毒沙门氏菌作为重组基因的携带载体，可使重组基因的表达产物直接暴露于机体的免疫系统，而省却了上述的繁琐。这得力于减毒沙门氏菌可表达外源性抗原基因的能力，而口服后可寄生在体内， 所以可持久将异源抗原暴露于机体免疫系统，从而激发免疫应答， 且包括对机体细胞免疫的激活。Sadoff等将伯氏疟原虫CSP基因克隆到含噬面体启动子的质粒，所得重组质粒转化鼠获得抵抗子孢子攻击的能力。含丝氨酸重复蛋白基因和富组氨酸蛋白Ⅱ基因的质粒转化SR-Ⅱ减伤寒杆菌毒株，并将其接种BACB/C鼠毒沙门氏菌株，免疫动物后也测得特异于上两种疟原虫抗原的IgM抗体。尽管抗原基因重组质粒可由减毒沙门氏菌株介导在机体内直接表达而降低抗原受MHC Ⅰ的限制性，随之产生的特异细胞毒作用也加强了机体的免疫应答水平，但这种方法中，质粒的选择、重组质粒在转化菌株内的丢失及转移至其它菌株等问题的存在， 在临床应用仍有差距。[NextPage]

5、核酸疫苗  核酸疫苗彻底简化了基因工程蛋白疫苗的产生过程，而与基因工程减毒活疫苗有异曲同功之处：将抗原基因直接在机体表达，但却优于后者，核酸疫苗中不再需要生物作为载体，而是将含抗原基因的重组真核质粒直接接种于转染效力高，呈递抗原能力强的组织，而于此表达出已经水解、修饰空间构象几近天然的抗原蛋白。若抗原物质在APC 表达则与MHC I结合后可激活CTL产生细胞免疫；若抗原来源于其它细胞表达而被APC处理与MHC I结合则能激活TH细胞产生体液免疫。Hoffman等用含约氏疟原虫的特异性抗体和CTL反应，两种反应水平均高于减毒子的免疫，且显示对子孢子攻击小鼠有68%被保护。最近，一种复合价DNA疫苗，将恶性疟原虫不同发育时期的保护性抗原(CSP、PFSSP₂、LSA₁、MSP₁、SETA、AMA₁和Pfs25)基因重量组到高度减毒的牛痘病毒NYVAC基因组中，并将重组真核质粒接种猴，结果表明，该实验室疫苗安全、能诱导特异抗体产生，并已进入临床实验；国内李学荣等将含红细胞前，内期多个保护性抗原的基因重组入真核表达质粒得PcDNA3-Pf8，直接免疫BALB/c小鼠，检测到特异抗体存在，且所得免疫血清在体外能抑制恶性疟原虫生长、发育。尽管核酸疫苗在抗原目的基因、真核质粒选择方面有更多要求，如质粒的非复制性，对宿主DNA的非整合性，要求精确的接种途径及剂量，且核酸疫苗仍需要免疫佐剂，但核酸疫苗却以其众多的优点，如生产简便、成本低廉、稳定性好、安全、抗原免疫原性强、能诱导机体对抗原的细胞一体液免疫应答、免疫持久等而立足于疟疾疫苗领域，且发展潜力巨大，是疟疾疫苗的新希望。

    二、影响疟疾疫苗效果的因素

1、蛋白载体化学合成及基因工程亚单位疫苗内有抗原活性的表位常呈不具天然构象的短肽，这样的短肽难以诱导机体产生免疫应答，为增强其免疫活性，一般将抗原活性表位连于一蛋白载体，其目的在于(1)蛋白载体的存在可重塑抗原活性短肽的天然构象，如HBsAg/45肽融合蛋白，HBsAg颗粒将保护性疟疾抗原表位45肽呈现于颗粒表面，因形成了免疫活性区而具有很强的免疫原性；(2)蛋白载体带有外源性T细胞表位，这些表位与抗原活性表位联合共同诱导机体的免疫应答，如将CSP的(NANP)₃连接到破伤风类毒素上形成的融合蛋白作为疟疾疫苗的候选抗原，可诱导机体产生抗子孢子抗体。

2、免疫佐剂对分子─亚单位疫苗采用蛋白载体以增强保护性抗原的免疫活性的同时，尚可运用佐剂的非特异性作用增强抗原的免疫原性和反应原性。但具体选择何种佐剂尚需仔细斟酌。传统的福氏佐剂能提高机体对寄生虫的免疫力，但只适宜动物使用， 铝盐可应用于人体，但佐剂作用不强，且难于激发细胞免疫，胞壁酰二肽(MDP)可提高细胞免疫水平，白细胞介素-2及TNF等细胞因子、脂质体除具有佐剂作用尚有免疫增强作用，它们与特异的保护性抗原合用能增强特异性免疫应答水平。

3、遗传变异  影响疟疾疫苗有效性的遗传因素， 包括来自免疫接种的机体及疟原虫两方面。已证实机体免疫应答基因的多态性对疟疾的易感性起作用，特定的Ⅰ、Ⅱ类HLA 等位因基与脑型疟和严重疟疾贫血不发生有关。并且机体对疟原虫抗原的免疫应答也受MHC分子对疟原虫抗原识别的复制能被大多数MHC分子识别，不受MHC明显疟原虫保护性抗原才有能力作为疟疾疫苗的候选抗原，为此现在的疫苗抗原设计中，以连接外源T细胞表位来降低机体免疫应答基因对疫苗的限制性，增强机体对疫苗的免疫应答水的免疫逃避，疟疾疫苗的免疫保护不普遍，所以疟原虫种、株间的共同保护性抗原表位是构建疟疾疫苗候选抗原的基础。[NextPage]

4、候选疫苗的保护性预测  虽然当前的候选免疫原可经过抗原活性表位鉴定及对这些表位基因的基因重组获得，且一般靶表位没有或极少多态性，但这些候选疫苗有时不得不在缺乏了解其保护作用机制、缺乏恰当的检测方法对保护性效果进行预测的情况下，就作的现场试验，这往往导致疟疾研究有限资金的浪费；另外体外检测候选疫苗的保护性免疫，常采用免疫接种小鼠和猴，以其血清抗体水平变化及外周血细胞的增殖情况进行保护性判断，经动物实验所得结论推测在人体的有效性其可信度又如何呢?所以在确认候选疫苗有必要做保护性预测的同时，发展对有效的保护性检测方法也是重要的， 如在体外用免疫血清作阻断疟原虫入侵RBC实验以检测候选疫苗诱导的体液免疫可能的保护作用。

三、疟疾疫苗研究的复杂性

    疟疾疫苗常以若干疟原虫候选抗原来建立，恶性疟原虫已被鉴定的40 多种疟疾抗原中MSA₁、MSA₂、RESA、CSP、HSP和Psf48/45 等保护性抗原常被用作不同类型疟疾疫苗的候选抗原，但以它们为基础重组的多价亚单位疫苗候选物常不是高效的，其原因可能是每种不同的抗原是通过不同的机制发挥保护作用，通过不同的途径被呈递，为此疫苗成分间存在干扰，而获得多价高效疟疾疫苗的机率就有限。

一种候选疫苗必须从一系列体内、体外模型实验中获得必要的信息，如保护性程度，但目前仍不能通过动物模型直接评估候选疫苗的保护作用。因为人与动物间存在着机制差异及疟原虫对宿主也有极严格选择性的限制。

另外，疟疾疫苗作为外来力量会破坏几百万年来疟原虫与人宿主之间在自杀选择下建立的平衡，如干扰了天然免疫的发展，一旦停止使用疫苗，会留下大量的易感人群，诱发免疫耐受等负面作用，因此，在疟疾流行区人群使用疟疾疫苗的可行性是必须首先论证的。旅游者或士兵使用疟疾疫苗可降低疟疾发生，但目前仍没有一种疫苗的保护性是明显的。

所以，疟疾保护性临床疫苗的问世已迫在眉睫， 但对它的研制更应建立在对疟疾免疫机制深刻认识的基础上，建立在对疟原虫分子结构与功能更全面认识的基础上，另外，还必须确立疟疾疫苗在疟疾综合治理中的地位以便一些有价值的疟疾实验室疫苗尽早发挥应有的作用。

参考文献略

 

 

注：转载请注明出处，谢谢合作