董莹    云南省疟疾防治研究所  云南思茅  665000

全文发表于《中国寄生虫病防治杂志》2001年14卷1期61-63页

 

80年代中期出现了一种新技术，称为聚合酶链反应( P0lymerase  chain  reation，PCR)，其基本原理是在目的基因的两端人工合成两段寡核苷酸引物，在提取于水生嗜热菌中的DNA聚合酶TaqI作用下，以溶液中4种脱氧核苷酸为原料，以待测的目的基因为模板，在人工控制的变性温度、复性温度及延伸温度条件下，于短期内完成目的基因的体外扩增。PCR技术诞生之初最基本的用途之一是基因诊断。最近随着分子生物学及分子遗传学的进步、针对PCR系统中模板取材、引物设计的改良及PCR产物的不同运用，PCR技术及其用途被多层面、全方位地发展了，从而也显示了PCR技术在生命科学不同领域中运用的强大功能。本文首先就普通PCR 技术在各环节的革新方式作一简介，再例举不同PCR改良技术在各研究领域的运用。

一、针对PCR技术各环节的革新措施

1、引物的改良  引物的设计和选择是PCR技术的重要部分，直接关系到PCR的敏感性和特异性，通常需要了解基因背景信息而设计合成引物。随着所合成引物可裁信息量的增加，引物的职能也在不断增加，除了引导脱氧核糖核酸按模板限定聚合外，还可制造出特定的结构以便PCR 产物进一步用于基因片段克隆及或基因突变位点的鉴定。如对裂殖子表面蛋白1的17区基因片段(MSP1-17)的PCR扩增，其引物设计时，在正向引物上设计有Sal l限制性内切酶位点及起始码，反向引物上设计有BamH I限制性内切酶位点及终止码，由这对引物引导合成的DNA片段属于MSP-17 基因， 经Sal I和BamH I双酶切后的回收片段能与被同样双限制性内切酶切的puc18质粒载体重组。此处的引物的所含的4个功能序列为最终得到MSP1-17基因片段的克隆提供了便利。又如，对恶性疟原虫二氢叶酸还原酶(DHFR) 基因进行多态研究时， 所用PCR 引物F/3′末端以个别碱基替换的机制生成了Dra I限制性内切酶位点， 通过相应限制点性内切酶切后能灵敏地检测出该164号密码子为编码异亮氨基酸多态。又如，为了能直接从PCR扩增产物的指纹图鉴定恶性疟原虫多药抗性基因(Pfmdr1)片段的多态性，使DCW3引物3′末端的碱基以替换方式产生TAT序列，带该3 ′末端序列的引物只能扩增可与该引物产生全面互补、且含酪氨酸编码序列多态的Pmdr1基因， 从而对PCR产物的电泳分析就能鉴别酪氨酸编码的存在。另外，在PCR引物末端带上某种配体，以便PCR通过配体结合机制与别的系统联结，如扩增恶性疟原虫SSUrRNA基因序列中疟原虫种特异保守序列的引物5′末端结合有生物素， 带有生物素的PCR产物与包被在聚乙氯烯板上的亲和素结合，结合体可在荧光素标记的寡核苷酸探针介导下与ELISA系统相接。这种对引物的改良所建立的有PCR参予的系统其敏感性、特异性均高于一般PCR。

2、不同取材的模板  作为PCR扩增模板的DNA片段，通常是基因内的保守序列，以此DNA片段为模板的PCR扩增多只适用于基因诊断。随后由于对PCR技术的精确把握，人们可用mRNA模板经PCR技术建立cDAN文库，也能由已知的多肽分子经PCR技术克隆该多肽分子的基因，如由已知多肽氨基末端序列反推出这部分相应的基因序列，并据此指导mRNA-5′末端的引物合成，同时依据mRNA-3′末端多聚腺苷酸(poly-A) 序列指导合成多聚胸苷酸(poly-T)的引物，继而用PCR技术在上述引物的引导下从制备细胞的mPNA中合成出相应的cDNA，再依据引物设计时的酶切位点，将该cDNA克隆可表达载体中，进一步做基因研究或基因产物表达。为了建立DNA片段库，人们甚至可以用人工随机合成的核苷酸片段作为PCR扩增的模板，如俞乃昌等经人工合成的3′-17bp接25个随机核苷酸接20 bp-5′寡核苷酸列为模板，用互补于3′末端及5′末端的引物T7、Rev经PCR扩增得108 bp的双链DNA片段库供免疫诊断使用。PCR技术对模板序列的体外扩增使目的基因的获得较以往的基因重组技术、人工合成方式更简捷和经济。如套式PCR技术中第二对引物的扩增反应是以第一对引物的PCR产物为模板的，这种PCR改良技术其模板的特殊来源使PCR技术识别基因片段的敏感性和特异性都得到了提高。另外，在简单重复序列锚定PCR技术里， 由于采用了广泛存在于高等生物基因组中的微卫星DNA作为扩增模板，使得PCR扩增的微卫星标志用于构建遗传学图谱更方便。[NextPage]

二、各种PCR改良技术及用途

1、任意引物PCR  在进行生物种、株、生物型、种群及个体间鉴定和区分时，任意引物PCR(Arbitrarily primed PCR，ad-PCR)技术的运用优于限制性片段长度多态(RFLP)分析和普通PCR技术，因为PFLP分析时需要Southern blotting杂交费时费力，而PCR进行基因多态分析时需要预知靶DNA的核苷酸序列，以设计合成特异的扩增引物，为此都限制了这两种方法在基因图谱分析中的应用。AP-PCR却以一条单一的、由少数碱基组成的随机核苷酸序列作引物，对基因组DNA进行随机的PCR扩增，这些引物设计并不需要特异的核苷酸序列信息，且该引物可在1 个或多个位点与基因组DNA互补结合，导致中介未知区域的扩增，所扩增的DNA 片段在不同物种间显示不同的随机扩增多态性DNA(PAPD)带型用于鉴定区分。RAPD 资料还可作为基因标志进行基因图谱分析，多个随机引物对同一标本基因组DNA进行扩增的RAPD资料，通过适宜的统计分析能够提供更多的有关系统发生、亲缘关系之类的信息。但为了保证RAPD资料在分类研究、作为基因标志用于基因图谱分析时具有实用意义，则必须在所用引物、DNA多聚酶、反应条件等方面保持稳定，才能维护RAPD指纹图的可重复性。

2、套式PCR  由于套式PCR系统比一般PCR系统的敏感性和特异性都高，所以在进行基因片段多态分析时常被采用。与通常的单一引物对PCR不同，套式PCR 具有两对引物，在第一对引物引导的扩增反应结束后，第二对引物继续放大第一次的扩增产物，这使得套式PCR比单一引物对的PCR有了更高的敏感性和特异性。诸欣平等在套式PCR技术里采用两对特异于R2区的引物，以检测恶性疟原虫富谷氨酸蛋白基因片段的多态，作为鉴别恶性疟原虫不同基因株的依据，所检出的290 个基因株为来自泰国的154份恶性疟感染血样，从而表明泰国恶性疟原虫分离株常为多克隆组成，也为恶性疟原虫克隆株的检测提供了敏感的技术方法。而Manoj及Grobusch 在检测恶性疟原虫基因多态时，又对套式PCR系统中引物做了大胆的设计，他们均在套式PCR系统中第二对引物的3′末端做了碱基替换，且所建立的突变特异PCR( Mutation  SpecificPCR)和等位基因特异PCR(Allele Specific  PCR) 对恶性疟原虫基因片段经过两轮PCR扩增后，所得到的新核苷酸序列是快速、特异识别基因存在固定多态的基础。如Manoj在对恶性疟原虫二氢叶酸还原酶基因片段进行多态分析时所介绍的MS-PCR 套式系统，对该基因的722bp的片段进行第一轮PCR 扩增后， 第二对引物的反向引物‘F/’的3′末端以碱基替换方式制造出一个限制性内切酶位点(Dral)，该位点含编码异亮氨基酸密码突变形式，所以套式PCR产物能被Dral酶切时即证明基因片段为编码异亮氨酸密码突变形式。为了确保限制性片段长度多态分析的可靠性，在RFLP 阶段需要设置不同的对照，且RFLP是证实MS-PCR 所扩增基因片段含点突变形式不可缺省的步骤。而Grobusch等在对恶性疟原虫多药抗性基因1[Pfmdr1] 片段进行多态分析时，所采用的AS-PCR半套式系统，对该基因的329bp片段进行第一轮PCR扩增后， 在内引物的正向引物3′末端经过碱基替换产生TAT 序列，由此引导的第二轮PCR， 扩增出329bp片段中含酪氨酸编码的序列，从而能以半套式PCR产物是否存在，直接判定该位点的等位形式，即简化了对PCR扩增产物进一步分析的环节。

PCR技术常用于检测DNA及识别基因多态，且有极高的敏感性，但单纯PCR 结果分析有难度，且所能揭示的基因信息有限。为了增强PCR技术的功能，常将PCR系统与别的技术系统有机组合，以充分发挥PCR技术体外扩增基因时的特异性强、高效的优势。[NextPage]

3、免疫-PCR技术  为了对微量抗原及细胞表面抗原进行检测，将抗原抗体反应的特异性与PCR的高度敏感性结合构成了免疫-PCR技术。该技术的关键在于形成抗体-标记DNA偶联物，在实验中只需数百个抗原分子，经PCR放大后即可被检测，甚至在理论上可检测到1至数个抗原分子。这种灵敏度使免疫检测技术达到了一个新的高度。免疫-PCR主要由两个部分组成，第一部分是类似于普通酶联免疫吸附法(ELISA)的抗原抗体反应。第二部分即常规的PCR扩增和电泳检测。免疫-PCR与ELISA的区别就在于ELISA是以碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶来标记抗体，用颜色反应来表明阳性或阴性结果；而免疫-PCR则是以一段特定的双链或单链DNA来标记抗体，用PCR扩增抗体所连接的DNA，并对其进行电泳检测，因此是由PCR产物的量来反映抗原分子的量。故免疫-PCR的关键之处就在于用一个连接分子将一段特定的DNA连接到抗体上，在抗原和DNA之间建立相对应关系，从而将对蛋白的检测转变成对核酸的检测，且由于预先将抗体和标记DNA偶联，标记物及引物DNA又被设计为带有亲和配体，所以免疫PCR 技术既简化了实验操作又能获得高特异敏感的实验结果。如最初由Tskeshi 等建立的免疫PCR系统里，puc19标记DNA带有生物素， 链亲和素- 蛋白A 嵌合体既能与生物素化puc19结合，又能与固定在微滴定板上的抗原抗体复合物的抗体结合，对puc19的双链DNA进行PCR扩增、产物分析就可推知抗原-抗体反应的量，它可检测到600 个牛血清白蛋白抗原分子，其敏感度是碱性磷酸酶作为标记物ELISA方法10⁵倍。但Sano 免疫PCR系统里要用待测抗原包被于固体微滴定板上，所以不适应临床标本和难以吸附固相抗原的检测，且链亲和素未商品化及与生物素的结合由于其四价特性可导致多种生物素与亲和素结构模式，而降低整个免疫PCR方法的敏感性，为此Hendrickson等用异双功能化学交联剂预先将抗体和ssDNA标记连接，以形成标记DNA-抗体偶联物，特别是他们建立了一种新的、基于双抗夹心免疫模式的免疫-PCR，并用标上特异DNA序列的不同抗体同时检测多种抗原， 避免了免疫实验敏感性不足和在一个实验中检测抗原种类的局限，而且免疫PCR夹心模式可类似于常规的免疫实验操作，这就使得免疫PCR技术更适用。随着免疫PCR技术中适合标记物的不断产生、引物设计的更加合理等环节的优化，免疫PCR的功能将得到更充分的发展。

4、PCR-ELTSA 在进行致病因子检测时可通过显微镜直接检出病原体， 单克隆抗体检测病原体特异蛋白，DNA探针及PCR技术检测其遗传物质，但每种方法除适用于不同领域的诊断外，其自身技术系统也存在不足。如敏感性局限，需使用同位素，难以对大量样本进行即时诊断等问题。将高度敏感性的PCR 与酶底物显色系统结合构成的PCR-ELISA技术，可即时对大量样本进行特异而且敏感的病原体检测。该技术系统内特异性DNA探针的设置是保证PCR-ELISA敏感和特异的关键，因为PCR-ELISA的两个组成部分：常规的PCR扩增系统和类似酶联免疫吸附法显色系统是由它联结的。通常，引导PCR扩增的引物用生物素标记，经PCR扩增的待测病原体DNA，其PCR产物上带有生物素，能结合到业已包被于固体微滴定板上的亲和素，经碱变性后，PCR产物解链与标记有荧光素的特异探针产生杂交双链，再用标记有辣根过氧化物酶或磷酸酶的抗荧光素抗体与荧光素结合，加合适底物后即可产生显色反应，其反应强度经测OD值计算。由于PCR-ELISA技术的特异性遵循DNA分子杂交时的碱基配对关系，所以PCR反应有可能导致非特异性DNA片段被套扩增，但由于在ELISA系统中尚有特异性探针与PCR产物的杂交反应，从而保证了PCR-ELISA技术高度的特异性。张龙兴等用PCR-ELISA 技术建立了对恶性疟原虫(P.f)和间日疟原虫(P.v) 的鉴别诊断系统， 根据P. f 和P.vSSUrRNA基因序列中疟原虫种特异保守序列设计合成了一对通用引物，并在反向引物5′末端偶联上生物素，所用寡核苷酸探针分别为P.f和P.v特异，并在5′末端偶联上荧光素，经PCR-ELISA试验检测两种疟原虫未发生交叉反应，敏感性较PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测高，可达4个原虫/ul(P.f)和10个原虫/ul(P.v)。虽然ELISA 方法定量PCR扩增产物结果具有更高的稳定性和可重复性，但必须对寡核苷酸探针的长度、 浓度、 PCR 的扩增条件及DNA 杂交环境的质量做严格控制， 为此也才能使PCR-ELISA易于自动化操作和临床检测使用。[NextPage]

5、差异展示PCR及DNA示差分析技术  为了分析细胞在增殖、 分化及对外界刺激反应过程中某些特殊基因的表达，可以通过比较细胞在不同状态及不同分化阶段基因表达的差异，来发现新的分化表达基因。 以PCR 扩增为基础建立的差异展示PCR( Differential  Display  PCR， DDPCR) 及DNA 示差分析技术(  Representation Difference Analysis，RDA)正是以反向生物学原理发现差异表达新基因的技术。基于随机引物放大原理，用PCR技术以对照组和实验组细胞的全部mRNA为模板合成两组cDNA，通过两组细胞的cDNA的平行测序电泳，以分析比较两组细胞cDNA的差异，从凝胶中分离差异区带及提取cDNA作进一步分析。  DDPCPR较以建立减数文库再杂交、筛选差异新基因方法更快速有效，且应用这种方法已经克隆了一些重要的基因，如在血管损伤时特异转录的组织膜蛋白基因BART1，在人肺癌细胞中高表达的新基因N8。但这一技术在应用中也越来越暴露其不足，其中最明显的缺点就是假阳性率高，且由于是对细胞全体RNA作放大，工作针对性差。随后发展建立的RDA技术将减数杂交与PCR有机结合，首先提取对照组和实验组细胞总RNA，并提纯mRNA，经逆转录酶得cDNA 建立对照组与实验组两个基因文库，用内切酶分别消化两组cDNA，然后将实验组文库的5 ′末端接上设计的寡核苷酸链，将实验组DNA与对照组DNA按1:100的比例混合，经变性再复性后，只有来自实验组的自我复性差异分子的双链DNA5′末端含修饰物寡核苷酸链，通过补平所有双链3′端，采用互补于寡核苷酸序列的引物，经PCR将两端均含寡核苷酸链的差异DNA 双链分子以指数级放大。对照组与实验组同源的基因片段可形成DNA双链杂交分子，但只有单末端含寡核苷酸链，故经PCR扩增后只成线性放大，最后通过电泳分析，将占优势的差异分子克隆到载体上即可获得新分子基因及功能，采用RDA技术已有多处中分化差异表达基因片段及未知DNA片段被克隆测序，如从前B细胞系中克隆到6 个受咖啡因影响的特异性上调表达的基因。Lewis在筛选受C-myc上调和下调表达的基因时，共获得20 个差异表达片段，其中5个经测序证实为未知基因。总之，PDA为克隆新基因提供了特异性强、快速有效的方法，且由于是通过特异放大分化差异基因片段，所以对新基因的发现更灵敏，随着该技术在实际应用中不断完善、发展，一定会有助于生命科学的研究。

在四基点突变检测时，  PCR-单链构象多态技术也是灵敏的，通常单个核苷酸差异的DNA片段经SSCP能被检出。SSCP是将PCR产物变性成单链DNA片段，用分辩高的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同泳动速率的单链DNA，由于单链NDA内碱基的改变，会形成不同于原有碱基组成时的空间结构，表现为单链构象多态，不同构象DNA分子在电泳时速率即不一样。所以在已知基因序列信息情况下，设计特异引物引导完成SSCP技术适于检测生物DNA多态。朱乃硕等在对中国人CTLA-4基因V区进行多态研究时，经DNA 序列分析得中国人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的V区与国外报道在两个位点存在差异，即第54位密码子中国人为编码甲硫氨(ATG)，第110位密码子处为编码苏氨酸(ACC)，且经过SSCP对CT-LA-4的扩增产物的分析也证实，中国人与外国人间V区基因存在多态，中国人该区呈高度保守性。

总之，PCR技术在体外扩增基因时的高敏感性、特异性和高效性使得基因重组、基因研究的针对性更强；而以PCR为基础，同时与恰当的技术匹配则使得PCR技术更具生命力，并且这也将是PCR技术的展趋势。

参考文献略

 

 

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