获1996年度云南省科技进步三等奖

获奖者：杨恒林  刘德全  车立刚   黄开国   杨亚明

李兴亮   李春富   杨品芳   董莹   张春勇

1、云南省疟疾防治研究所  2、中国预防医学科学院寄生虫病研究所

 

云南恶性疟发病人数和死亡人数居全国各省区之首，其病例主要分布于中缅、中老、中越边境一带和滇中部分地区的43个县市内，80年代初的监测结果证实中缅、中老边境地区恶性疟原虫对氯喹普遍产生了高度抗性，中部地区亦有50%左右的原虫对该药产生了抗性。80年代中期以为，已逐步采用青蒿素类药物替代氯喹用于恶性疟的治疗。为探索恶性疟原虫对新抗疟药敏感性现场体外监测方法，了解云南及境外恶性疟原虫对这些药物的敏感性及其各药敏感性间的相互关系，我们于1988－1995年开展了该项研究。

材料与方法

一、监测点  在云南东南部的个旧市曼耗镇（北纬23°5′，东经103°20′）南部的勐腊县（北纬21°10′，东经99°50′）及西部瑞丽县（北纬24°1′，东经97°50′）设点，对来自11个县市及境外缅甸、老挝的206例恶性疟病人采血进行测定。

二、血样  选择单一感染恶性疟原虫，无性体密度2000－80000个/μ血，未用过抗疟药、磺胺类及具有抗疟作用的抗类药物，尿中4-氨基喹啉及磺胺测定阴性的恶性疟患者，取静脉血待测。

三、培养基及测定板的制备  氯喹、氨酚喹、奎宁、甲氟喹、磺胺多辛/乙胺嘧啶测定板由WHO提供，青蒿琥酯粉剂由桂林第二制药厂提供，蒿乙醚，还原青蒿素、咯萘啶，蒿甲醚及哌喹粉剂由中国预防医学科学院寄生虫病研究所提供，载药板采用上海第三塑料厂生产的细胞毒反应板，哌喹用5%的乳酸溶解，蒿甲醚用苯乙醇溶解，其他药物用无水乙醇溶解。按不同浓度稀释后，加入各测定板2－9井中（1及10井作无药对照），干燥、消毒密封后备用。培养基按刘德全等介绍方法制备。

四、测定方法与抗性标准，测定采用WHO推荐的Rieckmamn体外微量法。对照井裂殖体（三个以上核）率≥20%为测定成功，反之为失败。以疟原虫能在8Pmol氯喹井，≥4Pmol咯萘啶井，≥2Pmol青蒿琥酯井，≥4Pmol还原青蒿素井，≥64Pmol蒿乙醚井及≥128Pmol蒿甲醚井，≥4Pmol氨酚喹井、≥64Pmol甲氟喹井、≥256Pmol奎宁井及≥32Pmol派喹井中发育至裂殖体分别为对各药的抗性标准。磺/乙合剂抗性标准尚未确定。

 

结    果

共测定氯喹206例，成功163例（其中38、63、10、23及29例分别为滇东南、滇南、老挝、滇西及缅甸感染者），测定成功率为79.1%。咯萘啶、青蒿琥酯、还原青蒿素、蒿乙醚、蒿甲醚测定成功率分别为79.7%（122/153）、80.9%（131/162）、79.8%（99/124）、75.0%（93/124）及73.5%（25/34）。

各地原虫对以上药物的抗性率、各种药对各地原虫的半数抑制量（ID₅₀）、完全抑制浓度（ID₉₅）、完全抑制裂殖体形成的平均浓度（CIMC）相比较。滇东南恶性疟原虫对氯喹的抗性率低于其他各地（P<0.05）、ID₅₀、ID₉₅及CIMC与老挝及滇南相似，但明显低于缅甸及滇西（P<0.05）。来自老挝的恶性疟原虫对青蒿素类药物均敏感，ID₅₀、ID₉₅及CIMC与滇东南基本相似，但明显低于其他各地。滇南恶性疟原虫对咯萘啶抗性率与其他各地相似，但ID₅₀、ID₉₅及CIMC明显高于老挝。抗氯喹恶性疟原虫对哌喹及氨酚喹的交叉抗性率均为96.7%（29/30）。

青蒿琥酯 测定成功的131例中，117例属敏感，14例属抗性。抗性株的ID₅₀及CIMC比敏感株分别高出2.0及5.6倍；还原青蒿素、蒿乙醚、咯萘啶、氯喹株ID₅₀比青蒿琥酯敏感株分别高出2.0、1.5、0.9及0.1倍；CIMC依次高到6.3、3.8、1.4及0.4倍。抗青蒿琥酯恶性疟原虫对还原青蒿素、蒿乙醚、咯萘啶的抗性率明显高于青蒿琥酯敏感株；对氯喹无差别。[NextPage]

咯萘啶敏感株和抗性株的相比，抗性株的ID₅₀及CIMC较敏感株高出1.8及3.8倍。抗性株对青蒿琥酯、还原青蒿素、蒿乙醚及氯喹的抗性率与敏感株基本相似；ID₅₀分别高出0.6、1.2、0.8及0.1倍，CIMC依次高出1.7、1.2、2.1及0.9倍。

哌喹测定成功65例，其中滇南28例、滇东南37例。滇南恶性疟原虫的抗性率明显高于滇东南（P<0.05）；ID₅₀、ID₉₅及CIMC分别是滇东南的1.40（320/228）倍、1.58（2426/1536）及1.80（1988/1102）倍。

甲氟喹测定和奎宁测定结果显示，恶性疟原虫对2种药物均敏感，各地的ID₅₀、ID₉₅及CIMC基本相似。

 

讨    论

云南恶性疟分布于43个县市，本研究的监测对象来自具有一定代表性的红河、个旧、金平、元阳、河口、勐腊、江城、景洪、瑞丽、畹町、陇川11个县市及境外的老挝、缅甸。测定结果可反映云南及境外恶性疟原虫对青蒿素类药物及咯萘啶、氯喹的敏感性。对改善这一地区恶性疟的防治，指导合理用药，防止和延缓恶性疟原虫对这些抗疟药的抗性具有重要意义。

测定结果表明滇东南、滇南、滇西及邻国恶性疟原虫对氯喹仍存在抗性，其抗性程度有一定差别。除来自老挝的原虫未发现对青蒿素类药物有抗性外，其他各地均发现少数原虫对该类药及咯萘啶产生了抗性，但大部分原虫对这些药物是敏感的，它们可替代氯喹用于抗氯喹恶性疟的治疗，但应加强敏感性监测。

本研究中，抗青蒿琥酯恶性疟原虫对还原青蒿素、蒿乙醚及咯萘啶的ID₅₀、CIMC均明显高于青蒿琥酯敏感株，抗性率亦然，提示抗青蒿琥酯恶性疟原虫对同类药及咯萘啶有交叉抗性的征兆。抗咯萘啶株、抗青蒿琥酯株原虫对氯喹的抗性率、ID₅₀、CIMC与咯萘啶及青蒿琥酯敏感株相似，提示抗咯萘啶、抗青蒿琥酯恶性疟原虫对氯喹似无交叉抗性。

自80年代中其以来，在云南南部、西部普遍采用青蒿素类药物治疗恶性疟，东南部80年代末亦广泛使用该类药物，邻国老挝很少使用这类药物，本研究中来自老挝感染的原虫对青蒿素类药的敏感性明显高于滇南及滇西。这可能与药物压力不同有关。此次测定结果与作者等1988年在滇南同一地区的测定结果相比，显示恶性疟原虫对这2种药的敏感性呈下降趋势，其速度咯萘啶明显快于青蒿琥酯。咯萘啶在云南除作过临床研究外，尚未广泛使用，其抗性的产生与抗青蒿琥酯恶性疟原虫对该药有交叉抗性有关。提示恶性疟原虫可在药物压力下对青蒿琥酯产生抗性，其速度较为缓慢；恶性疟原虫可随着对青蒿琥酯敏感性的下降而迅速对咯萘啶产生抗性。

80年代初证实滇南、滇西恶性疟原虫对氯喹普遍产生抗性。滇东南因当时恶生疟病例较少，而未测定。本研究首次证实当地恶性疟原虫已普遍对氯喹产生了抗性。该药一直被作为当地防治疟疾的主要药物，广泛用于群众性预防服药和假定性治疗，抗性的产生可能与此有关。另一方面当地近几年来恶性疟发病率急剧上升可能与恶性疟原虫对氯喹产生了抗性有关。对此有关部门应引起高度重视。

本研究测得80%以恶性疟原虫对哌喹、氨酚喹产生抗性，且发现95%以上抗氯喹恶性疟原虫对这2种药有交叉抗性。氨酚喹在云南尚未使用，抗性的产生与抗氯喹恶性疟原虫对该药有交叉抗性有关。云南近30年来一直使用奎宁治疗疟疾，但本次测的78例均敏感，提示抗氯喹恶性疟原虫对奎宁无交叉抗性；恶性疟原虫对奎宁不易产生抗性。甲氟喹在云南尚未使用，本次对滇南及滇东南39例原虫的测定结果证实，当地原虫对该药敏感，但有5例原虫接近抗性水平。测定结果为以后开展该药监测提供了基线数据。

本研究中制作的新抗疟药青蒿琥酯、还原青蒿素、蒿乙醚及咯萘定测定板测定成功率与WHO提供的氯喹等测定板相同，疟原虫生长亦随药物浓度的增高而依次下降。抗性率及敏感性的变化情况与体内法观察法得到的结果相吻合，提示这些药板药性稳定，测定果可靠，可推广使用。

 

以上成果已在中国寄生虫学与寄生虫病杂志，东南热带医学与卫生学杂志等发表论文15篇。

 

 

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