获1999年度云南省科技进步三等奖；省卫生厅科技进步二等奖

杨恒林  高白荷  黄开国

云南省疟疾防治研究所

 

摘要  目的：培育抗青蒿琥酯恶性疟原虫株，为延缓抗性等研究提供抗性品系；比较青蒿琥酯敏感株与抗性株原虫对9种常用抗疟药及2种抗菌素的敏感性。方法： 用人工方法对采自中缅、中老边境流行的恶性疟原虫间断给予青蒿琥酯刺激，在药物刺激前及用药后不同时间用WHO的体外微量法测定恶性疟原虫对上述药物的敏感性(ID₅₀)，并将结果对比研究。结果：用药前及用药后68和129d青蒿琥酯ID₅₀分别为9.6、30.6、85.1nmol/L，分别较用药前升高2.2、7.9倍。停药后67dID₅₀降到52.9nmol/L，下降37.9%。氯喹、甲氟喹、奎宁、本芴醇对抗性株与敏感株的ID₅₀无明显变化，而蒿甲醚、双氢青蒿素、萘酚喹、诺氟沙星(氟哌酸)、甲硝唑对抗性株的ID₅₀与敏感株相比上升达4倍以上，咯萘啶上升1.9倍。结论：可用人工方法建立抗青蒿素类恶性疟原虫，其抗性产生速度明显快于抗性下降速度。抗青蒿琥酯恶性疟原虫对蒿甲醚、双氢青蒿素、诺氟沙星、甲硝唑存在明显交叉抗性； 对咯萘啶有交叉抗性征兆；对氯喹、甲氟喹、奎宁、萘酚喹和本芴醇无交叉抗性。

    关键词：恶性疟原虫，抗青蒿琥酯虫株，抗疟药

 

抗氯喹恶性疟的出现与扩散严重的阻障着全球抗疟工作的进程， 为克服这技术难题WHO及有关国家和组织加强替代药物的开发研究，近40年来对30多万种化合物进行筛选。目前可替代氯喹用于恶性疟治疗的药物仅有我国研制的青蒿素类药物、咯萘啶及国外开发的甲氟喹。最近研究证实， 我国恶性疟原虫对咯萘啶及青蒿素类的敏感性在缓慢下降，在泰缅、泰柬边境地区用标准甲氟喹治疗恶性疟，已有50%的病人难治愈，提示恶性疟原虫对新抗疟药产生抗性是不可避免的，抗性产生速度明显快于新药开发速度，迫切需要开展延缓抗性，保护新抗疟药的研究。

 

材料和方法

1、虫株来源  恶性疟原虫FccSM/YN株采自云南思茅(位于中老、中缅边境地区)，按Trage (1976)蜡烛缸培养法，建立体外传代培养。

2、抗药性的诱发  采用青蒿琥酯体外剂量递增间隔接触方法进行抗性培育，每周采制薄血膜3次，吉氏染色后计数每1000个红细胞内原虫数。培养物接触药液48小时后，用营养液离心洗涤2次，约经16.7d原虫繁殖率恢复正常， 然后再加大浓度重复前步骤继续培养，每次药物浓度增高1.6－3.2pmlo/L，直至原虫对青蒿琥酯产生抗性。

3、药物制备  青蒿琥酯静脉注射粉剂由桂林第二制药厂提供。药粉先用5% 碳酸氢钠1ml溶解，然后用双蒸水稀释到所需浓度经0.3μ微孔滤膜过滤灭菌后-20℃储存备用。临用前用培养液按实验所需浓度再作稀释。

4、测定板制备  无药测定板及氯喹、阿莫地喹、甲氟喹、奎宁测定板由WHO提供， 各板A井为对照，B井药量分别为1、0.25、2及4pmol。青蒿琥酯测定板及其各种药物测定板按以往介绍方法方法制备。本芴醇、萘酚喹、诺氟沙星、甲硝唑、 测定板1及12井为无药对照，第2井药量分别为0.32、0.125、1.25、1.2pmol，3－11 井依次倍增；测定青蒿琥酯敏感株的双氢青蒿素测定及青蒿琥酯测定板第2井的药量均为0.16pmol，测定抗性株测定板的药量分别为1.6及0.62pmol/井，3－11井依次倍增。 测试采用Rieckmann体外微时法。测试前用5%山梨醇对疟原虫作同步化处理， 将其稀释到20,000－60,000个/μl血，加5倍培养基稀释，混匀加入测定板各药井，从低浓度至高浓度每井加50μl，同时测定2组，培养24－30h收获，以对照井为基数计算各浓度井中的裂殖体抑制率[(1-药物井的裂殖体数/对照井数) ×100] 以回归法计算ID₅₀。

5、判断标准  青蒿琥酯对恶性疟原虫的ID₅₀较亲代成倍上升，能在40nmol/L以上浓度中生长，可认为对该药生产了抗性，相应的称为恶性疟原虫青蒿琥酯抗性株。如该株对其他某种药物的敏感性明显下降(ID₅₀较亲代成倍上升)， 可认为对该药存在交叉抗性。[NextPage]

 

结    果

1、青蒿琥酯抗性培育  疟原虫在接触药物前测得青蒿琥酯ID₅₀为9.6nmol/L，接触药物培养68d(上药4次，药物浓度为12.8pmol/L)，其ID₅₀增高至30.6nmol/L， 为亲代的3.2(30.6/9.6)倍，随着药物浓度的增高，其抗性水平亦继之上升，培养到129d( 上药7次，药物浓度为16pmol/L)，其ID₅₀值增高至85.1nmol/L，约为亲代的9倍。当停止接触药物，在无药液中培养67d后，其ID₅₀值降至52.9nmol/L，下降37.9%。

2、青蒿琥酯敏感与抗性株原虫对蒿甲醚、双氢青蒿素、 咯萘啶、本芴醇、萘酚喹、诺氟沙星、甲硝唑、氯喹、甲氟喹和奎宁的比较共测定46组，其中敏感株、抗性株各23组，各对照组抑制率为52－71%。抗性株与敏感株相比，青蒿琥酯、蒿甲醚、双氢青蒿素、 咯萘啶、 诺氟沙星及甲硝唑对抗性株的ID₅₀(nmol/L)较敏感株分别高出7.7(85.1/9.6)、4.5(80.5/14.6)、4.4(72.6/13.4)、 1.9(170.6/59.0)、7.1(9818.2/1215.9)、及26.6(35879.6/1303.3)倍；氯喹、奈酚喹对抗性株的ID₅₀较敏感株依次高出23.2%(112.0/90.6)及34.9%(119.4/88.5)倍； 甲氟喹(63.2/67.9)、奎宁(272.4/238.8)、本芴醇(66.8/72.3)无明显变化。

 

讨    论

在青蒿琥酯抗性培育中，疟原虫在接触药物后68d和129d，ID₅₀上升到亲代的3.2倍和8.9倍，停止药物刺激后67d，ID₅₀仅下降37.9%，但仍为亲代的5.5倍。 提示恶性疟原虫可在药物压力的刺激诱导下，在较短时间内产生抗性，其抗性产生和发展速度明显快于抗性下降速度。对此应影起高度重视。

上述8种抗疟药和2种抗菌素对以上敏感株(亲代)和抗性株的对比研究结果显示， 甲硝唑、诺氟沙星、蒿甲醚、双氢青蒿素、咯萘啶、对抗性株的ID₅₀较敏感株成倍上升；对氯喹、甲氟喹、奎宁、萘酚喹、本芴醇无明显变化。 提示抗青蒿琥酯恶性疟原虫对甲硝唑、诺氟沙星、蒿甲醚、双氢青蒿素存在明显的交叉抗性， 对咯萘啶有交叉抗性征兆；抗青蒿琥酯恶性疟原虫对氯喹、甲氟喹、奎宁、 萘酚喹和本芴醇无交叉抗性。鉴于青蒿素类药物皆具有共同的抗疟活动基因， 抗青蒿琥酯恶性原虫对同类药物中的蒿甲醚、双氢青蒿素有明显交叉抗性事实， 在培育抗青蒿琥酯恶性原虫的同时，培出了恶性疟原虫抗蒿甲醚和抗双氢青蒿素株。从理论上讲该类药物与上述无交叉抗性的药物伍用对延缓抗性可能具有一定的潜在价值，值得加强研究。 本研究和以往的研究结果提示在现场广泛使用青蒿素类药物的情况下， 恶性疟原虫迟早会对该类药物产生抗性。WHO对此十分重视，已将延缓恶性疟原虫抗性，保护新抗疟药作为研究发展方向。本项目作为抗性的基础研究对抗性机理探索、联合用药方案的筛选、复方剂型的开发等研究具有重要意义。（以上内容已在中国寄生虫学与寄生虫病杂志和中国寄生虫病防治杂志发表9篇）

 

 

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